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Mar 26, 2023

Morfogênese 3D in vitro do epitélio intestinal humano em um intestino

Protocolos da Natureza volume 17,

Nature Protocols volume 17, páginas 910–939 (2022) Citar este artigo

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A morfogênese intestinal humana estabelece a microarquitetura epitelial 3D e as características das criptas-vilosidades organizadas espacialmente. Essa estrutura única é necessária para manter a homeostase intestinal, protegendo o nicho de células-tronco na cripta basal de antígenos microbianos exógenos e seus metabólitos. Além disso, as vilosidades intestinais e o muco secretor apresentam células epiteliais funcionalmente diferenciadas com uma barreira protetora na superfície da mucosa intestinal. Assim, recriar a estrutura epitelial 3D é fundamental para a construção de modelos de intestino in vitro. Notavelmente, um intestino em um chip organomimético pode induzir morfogênese 3D espontânea de um epitélio intestinal com função fisiológica e biomecânica aprimoradas. Aqui nós fornecemos um protocolo reprodutível para induzir de forma robusta a morfogênese intestinal em um intestino microfluídico em um chip, bem como em um chip híbrido incorporado em Transwell. Descrevemos métodos detalhados para fabricação de dispositivos, cultura de Caco-2 ou células epiteliais organóides intestinais em configurações convencionais, bem como em plataformas microfluídicas, indução de morfogênese 3D e caracterização de epitélio 3D estabelecido usando várias modalidades de imagem. Este protocolo permite a regeneração da microarquitetura intestinal funcional, controlando o fluxo de fluido basolateral em 5 d. Nosso método de morfogênese in vitro emprega tensões de cisalhamento fisiologicamente relevantes e movimentos mecânicos e não requer manipulação ou engenharia celular complexa, o que pode ser vantajoso em relação a outras técnicas existentes. Prevemos que nosso protocolo proposto pode ter um amplo impacto nas comunidades de pesquisa biomédica, fornecendo um método para regenerar camadas epiteliais intestinais 3D in vitro para aplicações biomédicas, clínicas e farmacêuticas.

Foi demonstrado experimentalmente que as células Caco-2 epiteliais intestinais cultivadas em um intestino em um chip1,2,3,4,5 ou em um dispositivo microfluídico de duas camadas6,7 podem sofrer morfogênese 3D espontânea in vitro sem uma compreensão clara de o mecanismo subjacente. Em nosso estudo recente, identificamos que a remoção de antagonistas de morfogênio que são secretados basolateralmente da configuração de cultura é necessária e suficiente para induzir morfogênese epitelial 3D in vitro, verificada tanto com Caco-2 quanto com epitélio organoide intestinal derivado de paciente4. Neste estudo, focamos especificamente na produção celular e no perfil de concentração de um potente antagonista Wnt, Dickkopf-1 (DKK-1), tanto no intestino em um chip quanto em um dispositivo microfluídico modificado que contém um inserto Transwell, chamado um 'chip híbrido'. Confirmamos que adições exógenas de antagonistas Wnt (por exemplo, DKK-1, fator inibitório Wnt 1, proteína 1 relacionada a frizzled secretada ou Soggy-1) em um intestino em um chip resultam na inibição da morfogênese ou na interrupção de camadas epiteliais tridimensionais pré-estruturadas, sugerindo que a pressão antagônica durante o cultivo é responsável pela morfogênese intestinal in vitro. Assim, abordagens práticas para morfogênese robusta em uma interface epitelial são remover ou manter minimamente o nível de antagonistas Wnt no compartimento basolateral por lavagem ativa (por exemplo, no intestino em um chip ou plataformas de chip híbrido) ou difusão o caldo de cultura basolateral (por exemplo, da inserção do Transwell para um grande reservatório basolateral no poço).

Neste protocolo, fornecemos métodos detalhados para fabricar um microdispositivo de intestino em um chip e um chip híbrido inserível Transwell (etapas 1 a 5), ​​cultivando células epiteliais intestinais em uma membrana porosa à base de polidimetilsiloxano (PDMS) (etapas 6A, 7A, 8, 9) ou a membrana de poliéster de um inserto Transwell (Etapas 6B, 7B, 8, 9) e indução da morfogênese 3D in vitro (Etapa 10). Também identificamos características celulares e moleculares que são indicativas de histogênese específica do tecido e citodiferenciação dependente de linhagem, aplicando várias modalidades de imagem (etapas 11 a 24). Induzimos a morfogênese usando células epiteliais intestinais humanas, como Caco-2, ou organoides intestinais, em ambos os formatos de cultura com detalhes técnicos, incluindo modificação da superfície de uma membrana porosa, criação de uma monocamada 2D e recapitulação do microambiente bioquímico e biomecânico do intestino em vitro. Para induzir a morfogênese 3D de uma monocamada epitelial 2D, removemos os antagonistas morfogênicos em ambos os formatos de cultura, fluindo o meio de cultura para o compartimento basolateral das culturas. Finalmente, fornecemos exemplos representativos da utilidade das camadas epiteliais 3D regenerativas que podem potencialmente ser usadas para simular crescimento epitelial dependente de morfogênio, coculturas longitudinais hospedeiro-microbioma, infecção por patógenos, lesão inflamatória, disfunções da barreira epitelial e terapêutica baseada em probióticos efeito.